Zarówno biotechnologia, jak i mikrobiologia są gałęziami ogólnego terminu “Life Science” obejmującego wszystkie nauki badające struktury życia. Ilość leków farmaceutycznych produkowanych przez mikroorganizmy jest ogromna i od dawna powszechnie stosowana w przemyśle, zwłaszcza w przypadku przeciwciał monoklonalnych, prostszych białek, a nawet mniejszych cząsteczek. Do ekspresji białek terapeutycznych najbardziej pożądanym mikroorganizmem jest Escherichia coli (E. coli), ze względu na szybki wzrost, wysoką wydajność produktu i łatwość skalowania procesu.
Wraz z początkiem pandemii COVID19 w centrum uwagi znalazły się nauki Life Science, a szczególnie biotechnologicznie produkowane szczepionki na bazie mRNA (np. Tozinameran firmy BioNTech/Pfizer). Przed produkcją tych substancji na większa skalę pojawia się jedno wyzwanie: większość szczepów mikroorganizmów (np. E. coli, S. cerevisiae lub komórki CHO) nie produkuje pożądanych związków w sposób naturalny i trzeba je stymulować, aby uzyskać wysoką wydajność docelowej produkcji. Powszechnie stosowaną w przemyśle metodą rozszerzania spektrum produktów lub zwiększania ich wydajności w komórkach E. coli lub drożdży jest pobieranie egzogennego DNA w postaci wektora plazmidowego. Metoda ta jest nazywana transformacją DNA i polega na dodaniu informacji podobnych do blue print do komórki, która następnie jest w stanie wyprodukować pożądany związek na podstawie wektora plazmidowego.
W niniejszym artykule przedstawiamy, w jaki sposób ten istotny etap badań biotechnologicznych może być przeprowadzony przy użyciu produktów IKA®. Eksperyment ten jest kluczowy, dlatego należy zminimalizować źródła błędów, co wymaga dobrych i niezawodnych urządzeń. Pomożemy Ci, oferując doskonale działające produkty i elastyczne rozwiązania, dzięki którym Twoje wyniki będą dokładne i powtarzalne. Ukażemy etapy transformacji plazmidów w odpowiednich komórkach E. coli metodą szoku termicznego, a nasza głęboka wiedza na temat kontroli temperatury, wytrząsania i dozowania pomoże jeszcze bardziej usprawnić rutynowe czynności laboratoryjne.
Stół laboratoryjny
Do wykonania tych czynności niezbędny jest szereg urządzeń, widocznych na stanowisku laboratoryjnym rysunku nr 1. Wszystkie są dostarczane przez firmę IKA i zalecane przez naszych ekspertów.
Rysunek 1. Typowy zestaw urządzeń do używany do procesu transofrmacji plazmidowej E.Coli – pipety IKA Pette, Termowsytrząsarka Matrix Orbital Delta Plus, Łaźnia wodna ICC control, inkubator z wytrząsaniem KS 4000 ic
Pipety automatyczne IKA PETTE – dokładne dozowanie mikrolitrów
W eksperymencie transformacji produkt ligacji jest dodawany do bakterii kompetentnych. Oba składniki dodawane są w małej objętości, w przypadku bakterii zwykle od 20 do 100 μl, a produkt ligacji od 1 do 10 μl. Przy pracy w takich warunkach dokładność i precyzja pipety ma ogromne znaczenie. Pojedyncza kropla może prowadzić do ogromnych odchyleń (>10%), co może mieć katastrofalne skutki dla wyników i odtwarzalności procesu.
Łaźnia wodna ICC control – szok termiczny
Mimo że absorpcja wektorów plazmidowych może zachodzić w sposób naturalny, zdarza się to rzadko i nieselektywnie, dlatego w nauce stosuje się techniki “sztucznej” transformacji, aby osiągnąć wyższą wydajność. Często wybieranym narzędziem jest transformacja DNA komórek bakterii kompetentnych metodą szoku termicznego. Kompetentne komórki E. coli są mieszane z produktem ligacji lub wektorem plazmidowym, który koduje produkt docelowy. Następnie mieszanina jest inkubowana w lodzie przez 30 min. Kolejno zostaje przeniesiona do łaźni wodnej i poddana szokowi termicznemu w temperaturze 42 °C przez 30-60 s, w zależności od próbki. Wydajność przemiany po 30 s różni się znacznie między temperaturami 40, 42 i 44 °C. Dlatego stosowane urządzenie do termostatowania musi być niezawodne, a rozkład ciepła jednorodny w całym medium.
Termowytrząsarka IKA MATRIX Orbital Delta Plus – inicjacja wzrostu komórek
Po szoku termicznym komórki E. coli są przenoszone do lodu na kolejne 2 minuty, co stanowi drugi szok termiczny. Niska temperatura ogranicza ruch DNA i w ten sposób umożliwia dalsze wiązanie pozostawionych plazmidów na powierzchni komórki, co z kolei sprzyja pobieraniu plazmidów przez komórkę podczas inkubacji w następnym etapie. Aby zapewnić optymalne warunki wzrostu komórek poddanych szokowi termicznemu, do bakterii dodaje się wstępnie ogrzaną pożywkę SOC, zawierającą wiele składników odżywczych. Składniki te umożliwiają optymalny i szybki wzrost bakterii. Aby zwiększyć wiązanie plazmidu i zainicjować wzrost komórek, bakterie inkubuje się wstrząsając przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Na tym etapie należy zapewnić stabilną temperaturę, aby zmniejszyć stres komórkowy i stworzyć idealne warunki wzrostu. Termowytrząsarka MATRIX utrzymuje stabilną temperaturę 37 °C z odchyleniem gradientu poniżej 0,1 °C.
Inkubatory KS 4000 – hodowla bakteryjna
W ostatnim etapie transformacji komórki bakterii przenoszone są na szalki Petriego z podłożem zestalonym, zwykle zawierającym antybiotyki, aby zapewnić wzrost pożądanego szczepu. Zazwyczaj szalki Petriego inkubuje się przez noc w temperaturze 30 °C lub w 37 °C, jeśli wymagany jest szybszy wzrost kolonii. Dlatego używany inkubator musi utrzymywać zadaną temperaturę na stałym poziomie przez długi czas. Gdy transformacja DNA zakończy się sukcesem, na płytkach pojawią się małe kolonie, z których każda będzie przypominać pierwotną kompetentną komórkę z wbudowanym wektorem. Aby z tych zmanipulowanych komórek otrzymać nawet najmniejszą ilość pożądanego produktu, potrzebne są znacznie większe objętości kultur bakteryjnych. Dlatego kolonie bakterii są pobierane z szalek Petriego i przenoszone do większych naczyń, takich jak kolby Erlenmeyera, wypełnione pożywką nukleotydową, aby zapewnić bakteriom kontrolowane i idealne środowisko. Wzrost tych hodowli może trwać nawet kilka dni, przy czym istotna jest nie tylko temperatura 37°C, ale także wytrząsanie płynnych hodowli. Odpowiednie wytrząsanie jest konieczne, aby zapewnić napowietrzenie i zapobiec sedymentacji komórek. W zależności od wielkości hodowli i mikroorganizmu, wymagane jest wytrząsanie z prędkością do 300 obr/min. W tym przypadku niezbędny jest inkubator, który zajmuje mało miejsca, jest konfigurowalny i może pomieścić różne rodzaje naczyń.
O firmie IKA
Oferujemy szeroką gamę urządzeń laboratoryjnych i analitycznych do wielu zastosowań w pracach badawczo-rozwojowych. Liderzy rynku ufają naszej sprawdzonej technologii do lat. Zdobyliśmy wiodącą pozycję na światowym rynku dzięki innowacyjnym rozwiązaniom. Stale wprowadzamy nowości do naszego portfolio, aby usprawnić pracę wszystkim naukowcom. Nasza wykwalifikowana kadra czeka na Państwa pytania!
Źródło: Plasmid DNA transformation in E. coli: Considerations of Essential Lab Equipment, Authors: Nils Haupt, Christina Wiggenhauser, IKA Werke Staufen
REKLAMA
